Moleküler Mikrobiyoloji Laboratuvarı

Tıp Fakültemizde moleküler mikrobiyolojik tetkiklerin yapılması 1994 yılına uzanmaktadır. Eski fakülte binasının 1. katında kurulan yaklaşık 30 m2’lik bir laboratuvarda ilk PCR testleri yapılmaya başlanmış ve daha sonra hastanenin rutin hasta hizmetinde görev almıştır. Turgut Özal Tıp Merkezi’nin 1996 yılında tamamlanarak hizmete açılması ile birlikte moleküler mikrobiyoloji laboratuvarı, hastanenin G-blok 3. katındaki yerine taşınmış ve o günden beri aynı yerde çalışmalarına devam etmiştir.

Yıllar içinde gelişen moleküler tanı yöntemleri laboratuvarımızda da yerini almış ve aktif olarak rutin klinik tanı ve araştırma amaçlı kullanıma sunulmuştur.

Moleküler mikrobiyoloji laboratuvarında günümüzde uygulanmakta olan en son tanı yöntemleri bulunmaktadır. Bunlar; Nükleik Asit Amplifikasyon Yöntemleri: In-house PCR, Real Time PCR, Multipleks PCR Moleküler Tiplendirme Yöntemleri: Ap-PCR, Restriksiyon Fragment analizi, Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE), MLST DNA dizi analizi (DNA sequencing)

Kütle Spektrometre: Maldi Tof MS sistemi Bunların dışında, moleküler mikrobiyoloji laboratuvarımız içinde tüberküloz tanı laboratuvarı da bulunmakta olup bu laboratuvar Sağlık Bakanlığı tarafında referans laboratuvar olarak kabul edilmiştir. Tüberküloz laboratu- varında otomatize tüberküloz kültürü, konvansiyonel kültür, aside dirençli boyama yöntemi, tüberküloz ilaç direnci, tüberküloz PCR ve kütle spektrometrik tip tayini işlemleri yapılmaktadır. Yukarıda sayılan yöntemlerin koordine olarak kullanımı ile her türlü klinik örnekte bakteri, virüs ve mantar etkenleri tanımlanabilmektedir.

In-House PCR ve Nested PCR: Polimerize zincir reaksiyonu tabanlı olarak geliştirilmiş bu yöntemde mikrop- ların DNA veya RNA moleküllerinin spesifik bölgeleri için dizayn edilmiş DNA primeleri kullanılarak mikroorga- nizmanın genomundaki özel bir bölgenin laboratuvar ortamında çoğaltılması ve elde edilen ürünün agaroz jelde elektroforeze tabi tutularak gösterilmesidir. Bir klinik örnekte veya test edilen numunede hedef etkenin nükleik asidi mevcutsa çoğaltılan bölge spesifik DNA bandı olarak izlenmektedir. Bu testte temel olarak verilen sonuç araştırılan mikrobun örnek içinde olup-olmadığının saptanmasıdır

Gelişen teknoloji ile bu işlemler bilgisayar kontrollü ortamlarda yapılmaya başlanmış ve ço- ğaltılan DNA bölgesi ortamda bulunan boya maddesi ile tepkimeye girerek belli dalga boylarında ışıma sağla- maktadır. Oluşan bu ışıma hassas dedektörler ile algılanarak numerik değerlere dönüştürülmektedir. Bu yön- temde hedef mikrobun örnekte olup olmadığı ile birlikte aynı zamanda mikroorganizmanın örnek içindeki sayısı da (kantitasyon) saptanabilmektedir.

Menenjit gibi bazı enfeksiyonlarda, hastalığı yol açan etken spektrumu oldukça dardır. Bu amaçla birden çok etken için hazırlanmış özel DNA primerleri kullanılarak geliştirilmiş PCR yöntemleri mevcut- tur. Bu yöntemde, yaklaşık 20 civarında etkene kadar çalışma yapılarak tek seferde bunlardan herhangi biri veya bir kaçı hızla saptanabilmektedir.

AP-PCR: Bakterilerin spesifik DNA bölgeleri için seçilmiş primerlerin kullanılması sonucunda yapılan nükleik amplifikasyon tabanlı bir genetipleme yöntemidir. Böylelikle test edilen etkenin DNA parmak izleri oluşturul- makta ve özellikle hastane salgını gibi durumlarda izolatların genetik yakınlığınmın ortaya konulabilmektedir.

Bir mikrobun hedef bir DNA bölgesi PCR ile çoğaltıldıktan sonra bu ürün restriksiyon endonükleaz en- zimleri ile kesilmekte ve agaroz jelde elektroforez ile ayrıştırılmaktadır. Böylelikle etkenin kimliği tam olarak ay- dınlatılabilmektedir.

Bu yöntem günümüzde kullanılan genotipleme yöntemleri içinde referans metod durumundadır. Bakteri veya mantarın tüm DNA molekülü restriksiyon enzimleri ile spesifik böl- gelerinden kesildiktedn sonra yapılan bir elektroforez uygulamasıdır. Oluşan DNA bantları bir bilgisayar yazılımı ile değerldnirilip test edilen farklı izolatların birbirine olan genetik yakınlıkları saptanmaktadır. Özellikle hastane salgınlarının aydınlatılmasında oldukça önemli veriler sunmaktadır.

Bu yöntem, hücrede bulunan DNA molekülünün sahip olduğu baz diziliminin deşifre edilerek okunmasıdır. Böylelikle mikropların en hassas bir şekilde tanımlanması yapıldığı gibi aynı zamanda DNA’da oluşan mutas- yonların saptanması ve antibiyotik direnç genleri gibi sonradan kazanılan nükleik asit değişiklerinin tespit edil- mesi sağlanır.

Maldi Tof MS sistemi: Maldi Tof MS, 2009 yılından itibaren rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarında mikroorga- nizma tanımlama amacıyla kullanılmakta olan yeni bir yöntemdir. Bu yöntemde; bakteri ve mantar hücrelerine ait proteinler iyonize edilip moleküler kütlelerine göre ayrıştırmakta ve elde edilen protein spektrumu (2000- 20000 Dalton) mevcut referans spektrumla karşılaştırılarak test edilen mikroorganizmanın cins ve tür ayrımı yapılmaktadır.

Böylelikle, günümüzde yaklaşık 1040 farklı bakteri, maya ve küfün bu sistemle dakikalar içinde tanımlanabildiği gösterilmiş ve bunun için “IVD” ve “CE” sertifikasyonları tamamlanmıştır. Yapılan çalışmalarda sistemin cins düzeyinde ayrım gücü %93-100, tür düzeyindeki ayrım gücü ise %85 ila %100arasında bildirilmiştir.

Yapılan çalışmalarla bazı üreticiler tarafından Maldi Tof MS sistemine entegre olarak genotipik tiplendirmeye benzer bir şekilde mikroorganizmalar arasındaki yakınlığı gösterebilen yazılımlar üretilmiştir. Böylelikle bir salgın durumunda bakteri veya manatarın salgın suşu olup-olmadığı yine kısa bir süre içinde saptanabilir hale gelmiştir. Bu durum bir salgının henüz başlangıç aşamasında veri sağladığı için bu salgının hemen önenebilme- sine olanak tanımaktadır.